La influencia del sustrato quimioluminiscente en la detección de proteínas mediante membranas de PVDF.
El Western blotting es un método analítico para la inmunodetección de proteínas, en particular de proteínas de baja abundancia en una muestra dada.
Este proceso implica la transferencia de patrones proteicos desde un ENSAYO deelectroforesis en GEL de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) a una membrana microporosa mediante corriente eléctrica.
La transferencia de proteínas desde la membrana mediante Western blotting o elución electroforética puede realizarse mediante el método de transferencia húmeda, semiseca o seca. La elección del método de transferencia depende del tipo de información requerida, así como de la proteína, el tiempo y el coste.
La transferencia húmeda, que es el enfoque de esta nota de aplicación, es el método más común de transferencia y se describirá con más detalle en el siguiente párrafo. Las membranas microporosas más comunes utilizadas para la transferencia son celulosa, nitrocelulosa (NC), difluoruro de polivinilideno (PVDF), acetato de celulosa (CA), polietersulfona (PES) y nailon (NY).
Las membranas de PVDF se utilizan principalmente para el Western Blot debido a sus propiedades mecánicas, características superficiales y alta capacidad de unión. El proceso de Western blot húmedo se puede dividir en tres pasos: electroforesis SDS-PAGE, electrotransferencia (donde el sándwich consiste en un gel electroforético y una membrana sumergidos en un tampón de transferencia) y detección quimioluminiscente.
Cada uno de estos pasos puede influir en los resultados finales. La transferencia eficiente de proteínas de un gel a una membrana depende significativamente de la naturaleza del gel, el peso molecular de las proteínas que se transfieren y la membrana. Por ejemplo, la presencia de bandas demasiado claras o la ausencia de bandas podría deberse a un tamaño de poro demasiado grande en la membrana o a un tiempo de transferencia demasiado largo.
Además, la sensibilidad del sustrato quimioluminiscente también es un factor importante en el rendimiento del Western blot. En el paso de detección, la concentración local de anticuerpos y sustrato influye en la velocidad de la reacción quimioluminiscente. Por lo tanto, la velocidad de reacción cambia con el tiempo y a lo largo de la superficie del blot. Las bandas de baja intensidad consumen el sustrato disponible más lentamente que una banda fuerte con una alta concentración local del reportero de peroxidasa de rábano picante (HRP), lo que puede agotar rápidamente el sustrato disponible.
Siguiendo el protocolo general de GVS para Western blot, esta nota de aplicación compara el rendimiento de las membranas de transferencia GVS con las de la competencia para proteínas de 11 kDa, 42 kDa y 87 kDa de peso molecular. Se utilizan proteínas de diferentes pesos moleculares para comparar el tamaño del poro de la membrana con el tamaño de la proteína.
En la etapa de detección, las transferencias se incubaron en distintos sustratos quimioluminiscentes para ilustrar su sensibilidad a bajas concentraciones de la proteína diana. En el caso de las proteínas de 42 kDa, se utilizaron tres sustratos quimioluminiscentes diferentes para mostrar la influencia del sustrato en los límites de detección.
Aquí en este link sito debajo puedes encontrar una guía preparada por GVS para la solución de problemas comunes que ocurren con estas técnicas:
https://static.gvs.com/product-collections/attachments/202212211002-954d8ef22e87d549/GVS-Blotting-Troubleshooting.pdf